小反刍兽疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒说明书
兽用
本试剂盒适用于羊的扁桃体、淋巴结和脾脏等组织病料和血液等液体病料中的小反刍兽疫病毒(PPRV)核酸检测。
编号 | 名称 | 装量 | 编号 | 名称 | 装量 |
PPRV 01-q48 | PPRV qRT-PCR mix | 48管/盒 | PPRV 03-q48 | 阳性对照 | 20µlx8管/盒 |
PPRV 02-q48 | PPRV qRT-PCR Buffer | 1000μl | PPRV 04-q48 | 阴性对照 | 1000μl |
【保存期】 -20℃冷冻保存,有效期12个月。
【规格】 48检份/盒
【使用方法】
1、样品采集、处理和病毒核酸提取
样品参照《小反刍兽疫诊断技术》(GB/T 27982-2011)(www.qdregen.com下载中心)进行处理。使用核酸提取试剂盒则参照说明书处理样品。阳性对照在每个薄壁PCR反应管中加入20μlqRT-PCR Buffer复溶后直接使用,阴性对照与样品同步同样进行处理。
2、qRT-PCR反应体系的配制
每个反应体系20μl。在每个薄壁PCR反应管中加入18µl PPRV qRT-PCR Buffer进行复溶,然后加入2µl样品RNA、阳性对照和阴性对照RNA,标记并做好记录。
3、qRT-PCR反应程序的设置
1)48 ℃ 10 min;2)94 ℃ 3 min;3)94℃ 10s,60℃ 30s,共40个循环;设置60℃收集FAM荧光信号。
【结果判定】
1)阳性对照的Ct值小于等于28.0,同时阴性对照无Ct值且无扩增曲线,实验结果成立。
2)被检样品Ct值小于等于30.0,且出现扩增曲线,为小反刍兽疫病毒核酸阳性;被检样品Ct值大于等于40.0,判定为阴性;被检样品Ct值大于30.0小于40.0为可疑,需重新提取核酸重复检测仍为可疑则判定为阳性。
【注意事项】
1、本试剂盒说明书未单独说明的事项,均参照《小反刍兽疫诊断技术》(GB/T 27982-2011)。
2、PCR实验室应按功能分为配液区、样品处理区、扩增区、电泳区。物流方向依次为配液区→样品处理区→扩增区→电泳区。所有接触病料的物品、器具,尤其是PCR产物和使用后的电泳缓冲液均应合理处置,以免污染实验室。
3、所有试剂应在规定条件下储存。-20℃保存的试剂在使用前应完全融化,振荡混匀后,置冰盒中取用。使用后如短期内(1个月内)继续使用可以存放4℃;长期保存放置-20℃;尽量避免反复冻融,反复冻融试剂将减低检测灵敏度;严禁使用超过有效期限的试剂;严禁混用不同试剂盒组分。
4、严格按照国标和说明书要求操作。正确使用移液器,吸取液体时吸头尽量在液体上层吸取;做到移液量精准;吸取不同液体时必须更换移液器吸头,防止试剂组分污染以及样品污染。
5、试剂盒组分在生产分装时考虑到液体的损耗,实际装量略多于标注装量,因此严禁直接在原包装中配制反应体系,以免造成反应体系各组分比例不准确。
6、每次检测试验必须设阳性对照和阴性对照,而且阳性对照和阴性对照必须与待检样品同步处理,以验证提取试剂的提取效率以及是否被污染;验证qPCR反应体系的扩增效率以及是否被污染;验证试验中所用器材是否被污染。
7、试验操作过程中,操作人员做好个人安全防护,避免直接接触试剂组分,建议试验全程佩戴一次性手套。
8、需要自备的仪器:超净工作台、离心机、掌型离心机、qPCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、4℃冰箱、-20℃冰柜、可调移液器(20μl、200μl、1000μl)。
9、需要自备的耗材和溶液:1.5ml/2ml RNase-free离心管、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、蒸馏水、500ml量筒、吸头(10μl/200μl/1000μl)、一次性PE手套或者乳胶手套、油性记号笔。