小反刍兽疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒说明书

兽用

本试剂盒适用于羊的扁桃体、淋巴结和脾脏等组织病料和血液等液体病料中的小反刍兽疫病毒（PPRV）核酸检测。

【保存期】 -20℃冷冻保存，有效期12个月。

【规格】 48检份/盒

【使用方法】

1、样品采集、处理和病毒核酸提取

样品参照《小反刍兽疫诊断技术》（GB/T 27982-2011）（www.qdregen.com下载中心）进行处理。使用核酸提取试剂盒则参照说明书处理样品。阳性对照在每个薄壁PCR反应管中加入20μlqRT-PCR Buffer复溶后直接使用，阴性对照与样品同步同样进行处理。

2、qRT-PCR反应体系的配制

每个反应体系20μl。在每个薄壁PCR反应管中加入18µl PPRV qRT-PCR Buffer进行复溶，然后加入2µl样品RNA、阳性对照和阴性对照RNA，标记并做好记录。

3、qRT-PCR反应程序的设置

1）48 ℃ 10 min；2）94 ℃ 3 min；3）94℃ 10s，60℃ 30s，共40个循环；设置60℃收集FAM荧光信号。

【结果判定】

1）阳性对照的Ct值小于等于28.0，同时阴性对照无Ct值且无扩增曲线，实验结果成立。

2）被检样品Ct值小于等于30.0，且出现扩增曲线，为小反刍兽疫病毒核酸阳性；被检样品Ct值大于等于40.0，判定为阴性；被检样品Ct值大于30.0小于40.0为可疑，需重新提取核酸重复检测仍为可疑则判定为阳性。

【注意事项】

1、本试剂盒说明书未单独说明的事项，均参照《小反刍兽疫诊断技术》（GB/T 27982-2011）。

2、PCR实验室应按功能分为配液区、样品处理区、扩增区、电泳区。物流方向依次为配液区→样品处理区→扩增区→电泳区。所有接触病料的物品、器具，尤其是PCR产物和使用后的电泳缓冲液均应合理处置，以免污染实验室。

3、所有试剂应在规定条件下储存。-20℃保存的试剂在使用前应完全融化，振荡混匀后，置冰盒中取用。使用后如短期内（1个月内）继续使用可以存放4℃；长期保存放置-20℃；尽量避免反复冻融，反复冻融试剂将减低检测灵敏度；严禁使用超过有效期限的试剂；严禁混用不同试剂盒组分。

4、严格按照国标和说明书要求操作。正确使用移液器，吸取液体时吸头尽量在液体上层吸取；做到移液量精准；吸取不同液体时必须更换移液器吸头，防止试剂组分污染以及样品污染。

5、试剂盒组分在生产分装时考虑到液体的损耗，实际装量略多于标注装量，因此严禁直接在原包装中配制反应体系，以免造成反应体系各组分比例不准确。

6、每次检测试验必须设阳性对照和阴性对照，而且阳性对照和阴性对照必须与待检样品同步处理，以验证提取试剂的提取效率以及是否被污染；验证qPCR反应体系的扩增效率以及是否被污染；验证试验中所用器材是否被污染。

7、试验操作过程中，操作人员做好个人安全防护，避免直接接触试剂组分，建议试验全程佩戴一次性手套。

8、需要自备的仪器：超净工作台、离心机、掌型离心机、qPCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、4℃冰箱、-20℃冰柜、可调移液器（20μl、200μl、1000μl）。

9、需要自备的耗材和溶液：1.5ml/2ml RNase-free离心管、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、蒸馏水、500ml量筒、吸头（10μl/200μl/1000μl）、一次性PE手套或者乳胶手套、油性记号笔。